موضوع پایان نامه دکتری :بررسی عفونت ریوی مایکوپلاسمایی ناشی از مایکوپلاسما مایکوئیدس واریته مایکوئیدس و مایکوپلاسما کاپری کولوم واریته کاپری کولوم در گوساله‌ها و بزهای کشتارشده به روش PCR

مقدمه
عفونت پلوروپنومونی واگیر،‌ بیماری تحلیل برنده تنفسی است که با جای گرفتن در طبقه‌بندی بیماریهای سازمان جهانی کنترل بیماریهای واگیر، لزوم و اهمیت شناسایی آن مشخص شده است. عامل اصلی این بیماری، گونه مایکوپلاسما مایکوئیدس می‌باشد که تایپ کلونی کوچک آن  بطور اختصاصی به گله‌های گاو، خسارات فراوانی ناشی از همه‌گیری گسترده و مرگ و میر فراوان تحمیل کرده است.
تایپ کلونی بزرگ این گونه  همراه با دو گونه دیگر بنامهای مایکوپلاسما کاپری کولوم کاپری کولوم  و مایکوپلاسما مایکوئیدس کاپری  فرم غیرکلاسیک پلوروپنومونی واگیر را در گله‌های گوسفند و بز بوجود آورده‌اند. این بیماری در فرم کلاسیک، که عامل آن مایکوپلاسما کاپری کولوم کاپری پنومونی  شناخته می‌شود، خسارات اقتصادی سهمگینی در گله‌های بز و گوسفند موجب گردیده است.
از آنجائیکه منطقه خاورمیانه جزو مناطق مشکوک به آلودگی پلوروپنومونی واگیر محسوب می‌شود، حفظ وضعیت عاری بودن از عفونت در این منطقه، مشکل یا تقریبا غیرممکن بوده و نیازمند بازنگری درراهبردهای بکار رفته به منظور تشخیص و کنترل این عفونت‌هاست. عدم برخورداری از خصوصیت پاتوگونومیک تشخیصی و پاتولوژیکی‌، مسیر بیماریزایی ناشناخته و تنوع فنوتیپی بسیار پیچیده ارگانیسم در مواجهه با دستگاه ایمنی میزبان، بر مشکل شناسایی آن افزوده است. علاوه بر  این ، ابقا طولانی مدت باکتری در محل عفونت و وجود ناقلین بدون علامت‌، برنامه کنترل بیماری را با چالش روبرو کرده است.
از این رو، شناسایی و بکارگیری روشهای تشخیصی و تفریقی گونه‌های کلاستر مایکوپلاسما مایکوئیدس که هرکدام استراتژی جداگانه ای در برخورد با عفونت گله‌ها دارند، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است.
از آنجایی که مایکوپلاسماهای پاتوژن در محیط کشت به سختی رشد می‌کنند، استفاده  متداول از روش کشت و جداسازی، شناسایی عفونت گله‌ها را با مشکل روبرو کرده است.
از طرف دیگر، عمدتا به دلیل تشابه آنتی ژنتیکی بین گونه‌های کلاستر مایکوئیدس و سایر گونه‌های مایکوپلاسما، روشهای سرولوژی از دقت و ویژگی کافی در تمایز گونه‌ها برخوردار نیستند. لذا به رهیافت روش‌های مولکولی مانندPCR بعنوان روشی سریع،  دقیق و با حساسیت و ویژگی مطلوب در کنترل عفونت گله‌ها، توجه ویژه‌ای می‌شود.
هدف از این مطالعه، بررسی عفونت‌های تنفسی ناشی از کلاستر مایکوئیدس در  گله‌های نشخوارکنندگان از طریق کشت و PCR می‌باشد.

فهرست

عنوان ……………………………………………………………………………………… صفحه

الف- مقدمه                                                                                                                              1

ب-چکیده                                                                                                                                3

فصل اول:کلیات …………………………………………………………………………………………………………………………………………. 5

1- تاریخچه    ……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 6

2- خصوصیات کلی مایکوپلاسما…………………………………………………………………………………………………………….. 6

3- مقاومت مایکوپلاسماها………………………………………………………………………………………………………………………. 8

4- طبقه بندی مایکوپلاسماها…………………………………………………………………………………………………………………. 9

5- طبقه بندی کلاستر مایکوئیدس………………………………………………………………………………………………………… 12

6- فیلوژنی   ……………………………………………………………………………………………………………………………………………. 14

7- ساختمان  …………………………………………………………………………………………………………………………………………… 15

1-7-ساختمان مایکوپلاسما مایکوئیدس …………………………………………………………………………………………………… 15

2-7- ساختمان مایکوپلاسما کاپری کولوم …………………………………………………………………………………………… 17

8- بیولوژی مولکولی……………………………………………………………………………………………………………………………… 19

9- توالی‌های تکراری……………………………………………………………………………………………………………………………….. 23

10- پروتئینهای سطحی………………………………………………………………………………………………………………………….. 25

11- فاکتور حدت30

12- آنالیز پروتئین  32

13- طبقه بندی سویه‌ها 34

14- مشخصات گونه مایکوئیدس35

15- کشت و رشد گونه مایکوئیدس 38

16- کشت و رشد گونه کاپری کولوم 41

1-16- محیط Thiacourt  41

17- بیماری پلوروپنومونی واگیر گاوان44

1-17- علائم بالینی 45

2-17- علائم کالبدگشایی بیماری 47

3-17- پاتوژنز 50

1-3-17- مکانیسمهای مقابله با دستگاه ایمنی53

4-17- اختصاصیت میزبان57

5-17- انتقال بیماری  58

6-17- سیر همه گیری 59

1-6-17- مخزن59

2-6-17- راه انتقال59

7-17- پیشگیری و کنترل60

1-7-17- اقدامات لازم برای حفاظت مناطق عاری از بیماری61

2-7-17- اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری62

3-7-17- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی63

18- بیماری پلوروپنومونی واگیر بزان 63

1-18- علائم بالینی 64

2-18- علائم کالبد گشایی66

19- گونه مایکوپلاسما کاپریکولوم کاپریکولوم69

1-19- سندروم MASKePs70

2-19- علائم بالینی71

3-19- علائم کالبد گشایی71

4-19- سندروم آگالاکتیه واگیر73

20- گونه مایکوپلاسما کاپری 73

1-20- بیماریزایی 73

2-20- علائم کالبد گشایی74

21- سیر همه‌گیری75

1-21-مخزن  75

2-21-راه انتقال76

3-21-جمعیت میزبان77

22-پیشگیری وکنترل 77

1-22- اقدامات لازم برای محافظت مناطق عاری از بیماری77

2-22- اقدامات لازم هنگام شیوع بیماری78

3-22- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومی78

23-واکسن    79

1-23-واکسن MmmLC 79

2-23-واکسن Mccp 79

3-23-واکسن Mcc  79 79-اختصاصیت میزبان در کلاستر مایکوئیدس  80

فهرست

عنوان صفحه

25-تشخیص افتراقی80

1-25-شناسایی عامل بیماری زا ……..             81

1-1-25-بررسی میکروسکوپیک اگزودای ریه از طریق تهیه اسمیر یا برش بافتی81

2-25- تشخیص آزمایشگاهی 81

1-2-25- روش کشت و جداسازی81

1-1-2-25- انتخاب نمونه ها 82

2-1-2-25- آماده سازی نمونه ها 82

3-25- تستهای بیوشیمی83

4-25- روشهای سرولوژی85

1-4-25- عوامل موثر در آزمایشات سرولوژی 85

2-4-25- تست مهاری رشد  87

3-4-25- تست ایمونو فلورسانس 88

4-4-25- تست رسوب ژلی…….. 88

5-4-25- تست فیکساسیون کامپلمان 89

6-4-25- تست ممانعت از هماگلوتیناسیون 89

7-4-25- تست آگلوتیناسیون لاتکس90

8-4-25- تست الیزای رقابتی91

9-4-25- سایر تستهای تشخیصی94

5-25 – مشکلات روشهای سنتی94

6-25- تشخیص با استفاده از PCR95

فصل دوم: روش کار

26- روش کار 101

1-26- جمع آوری نمونه 101

1-1-26- مواد لازم101

2-1-26- بخش جمع آوری نمونه101

3-1-26- نمونه برداری 103

2-26- کشت و جداسازی نمونه ها104

1-2-26- مواد لازم 104

فهرست

عنوان صفحه

2-2-26- طرز تهیه محیط کشت اختصاصی برای جداسازی مایکوپلاسمای نشخوار کنندگان 106

1-2-2-26- مواد لازم 106

2-2-2-26- روش تهیه محیط کشت107

3-26- استخراج DNA مایکوپلاسما109

1-3-26- روش استخراج DNA از نمونه های ارسالی109

4-26- فرایند PCR 110

1-4-26- مواد لازم 110

2-4-26- آماده سازی مواد جهت واکنش PCR 112

1-2-4-26- افزوده سازی DNA نمونه‌ها 112

2-2-4-26- افزوده سازی DNA کلونیهای جدا شده115

3-2-4-26- تهیه مخلوط اصلی اولیه115

3-4-26- پرایمرها115

4-26- واکنش PCR117

5-26- تهیه ژل الکتروفورز 118

1-5-26- طرز تهیه محلول اتیدیوم برماید 119

6-26- الکتروفورز 121

7-26- رویت باندهای ایجاد شده 122

فصل سوم: نتایج

27- نتایج    124

1-27- جداسازی124

1-1-27- بررسی عملکرد محیط کشت124

2-1-27- نتایج کشت نمونه های ارسالی 124

1-2-1-27- نتایج روز پنجم  125

2-2-1-27- نتایج روزهفتم تا دهم125

3-2-1-27- نتایج روزپانزدهم126

2-27- نتایج  PCR  126

1-2-27- نتایج  PCR نمونه ها با پرایمر جنس 126

2-2-27- تائید کلونی های جدا شده127

3-2-27- نتایج  PCR نمونه ها با پرایمر کلاستر مایکوئیدس127

4-2-27- نتایج  PCR نمونه ها با پرایمر گونه آگالاکتیه128

5-2-27- نتایج  PCR نمونه ها با پرایمر گونه مایکوئیدس کلونی بزرگ129

3-27- نتایج کالبد گشایی130

1-3-27- معیار انتخاب 130

فهرست

عنوان                                                                                                                                                                       صفحه

فصل چهارم: بررسی نتایج

نمودارها       131

فصل پنجم: بحث

28- بحث      139

1-28- ضایعات کالبد گشایی139

2-28- میزان وقوع عفونت تنفسی مایکوپلاسما 141

3-28- روش کشت142

4-28- روش  PCR  147

5-28- فراوانی گونه ها 152

29- خلاصه انگلیسی159

30- منابع    160

Refrences:

1. Abdo E?M, Nicolet J, Frey J. (2000). Antigenic and genetic characterization of LPPQ from Mycoplasma mycoides mycoides Small Colony.Clin Diag Lab Immun.7:4, 588-593.

1. Adehan R?K, Ajuwape A?T?P, Adetosoye A?I, Alaka O?O. (2007). Biochemical and serological identificatrion of Mycoplsma isolated from pneumonic lungs of cattle. Philipine J Vet Med. 44:1, 8-13.

1. Alberti A,?Robino P, Chessa B, Rosati  S, Filippa Addis M, Mercier P, Mannelli A, Cubeddu T,?Profiti M, Bandino E, Thiery  R, Pittau M. (2007). Characteriterization of Mycoplasma capricolum capricolum P650 surface lipoprotein and its evaluation in a recombinant ELISA. Vet Mic.In Press.

1. Amanfu W, Sediadie S, Masupu K?V, Raborokgwe MV, Benkirane A, Geiger R, Thiaucourt F. (2000). Comparison between c-ELISA and CFT in detecting antibodies to Mycoplasma mycoides mycoides Small Colony in cattle affected by Contagious Bovine Pleuropneumonia in Botswana. Annals of the New York Academy of Sciences. 916: 364-369.

1. Arif A, Schulz J. (2007). Contagious Caprine Pleuro Pneumonia outbreak in captive wild ungurates at AlWabra Wildlife preservation. state of Qatar. J of Zoo and Wildlife Med. 38:1, 93-96.
2. Ayling R?D,?Nicholas R?A?J. (2005). Treatment of mycoplasmosis infections. Proceedings of the 38^th annual convention, American Association of Bovine Practitioners, USA. 2005: 6-10.

1. Barbosa V?P, Nascimento E R,?Danelli M, Nascimento M,?Santos M A J, Lignon G B, Ribeiro V R. (2000). Differentiation of Mycoplasma mycoides types causing mycoplasmosis in goats.Revista Brasilia de Veterinaria.?7:1, 33-36?

دانلود فایل